Sünteetiline elu: valmistatud nullist

Miks organismide ebaloomulike funktsioonidega varustamine nõuab paremat arusaamist bioloogiast, disainvalkudest ja hingeotsingutest.

Õlipiisad vees - levinud lähenemisviis lipiididega suletud algloomade loomiseks. Foto autor: A_Different_Perspective Pixabay. Vaata: https://www.nature.com/articles/ncomms6305

Sünteetiline bioloogia on teaduslik distsipliin, mille eesmärk on elusorganismide mõistlik kavandamine, tavaliselt geenitehnoloogiliste lähenemisviisidega (1). 1961. aastal tegid Francois Jacob ja Jacques Monod esmakordselt ettepaneku, et geneetilised regulatsiooniringid suunaksid raku käitumist (2). 2000. aastaks olid teadlased edukalt kavandanud ebaloomulikke geneetilisi ahelaid, implanteerinud neid mikroorganismidesse ja ahelad täitsid neile määratud funktsiooni. Varasemate näidete hulka kuulub geneetiline ümberlülituslüliti (3), kus kaks promootorit juhivad vastastikku pärssivate repressorite ekspressiooni, põhjustades raku "ümberlülitumist" püsiseisundite vahel, ja samal aastal tekkinud repressilator (4).

Geneetilised vooluringid on inspireeritud elektrilistest vooluahelatest ja need on üles ehitatud sarnastele põhimõtetele, autor on geralt Pixabay.

Tänapäeval on sünteetilise bioloogia püsiv eesmärk insenerimetoodikate rakendamine organismide ratsionaalseks modifitseerimiseks. Enamik sünteetilisi biolooge kirjeldavad biotehnoloogiat kui hierarhiat, milles osi (geene, DNA) kasutatakse seadmete (paljude geenide koos) ehitamiseks, mida saab omakorda kasutada süsteemide (paljude seadmete seeria) ehitamiseks (1). Sünteetilise bioloogia tõeliseks inseneridistsipliiniks muutmise väljakutse on see, et osad, mis on kõrgema järgu konstruktsioonide algelised ehitusplokid, on nende iseloomustamise rangusega põhimõtteliselt piiratud. See kehtib tõesti kõigis väljakujunenud inseneri erialadel. Näiteks elektrotehnikas on põhikomponente (transistorid, takistid, juhtmed jne) iseloomustatud nii hästi, et lapsed saavad neid kasutada ja sellest tulenevad vooluahelad käituvad ootuspäraselt. Kui kõik “osad” on standardiseeritud, võib sünteetilistel bioloogidel olla võimalik kasutada täiesti sünteetilisi eluvorme alt üles üles ehitada üksikuid DNA ehitusplokke.

Aristotelese büst. Foto autor: morhamedufmg Pixabay.

Sünteetilise elu idee on eksisteerinud aastatuhandeid. Aristoteles kirjutas 4. sajandil eKr oma raamatus „Loomade põlvkonnast” spontaanse põlvkonna kohta, milles väideti, et lagunev liha andis täiesti uued eluvormid. 20. ja 21. sajandiks olid kunstlikke eluvorme ümbritsevad tõsised eetilised probleemid. 2005. aastal tehti bakteriofaagi T7 viirus edukalt ümber, asendades 11 515 aluspaari DNA sünteetilise vormiga ja säilitatavate viirusosakeste elujõulisusega (5). Kaks aastat hiljem õnnestus J. Craig Venteril siirdada mikroorganismide vahel kromosoome (6) ja järgmisel aastal avaldas M. genitaliumil põhineva valmis kunstliku genoomi (7). 2010. aastal valmistati komponendid kokku ja sünteetilist genoomi sisaldav M. genitalium konstrueeriti edukalt (8).

Käimasolevas rahvusvahelises projektis nimega Synthetic Yeast 2.0 üritatakse konstrueerida esimest eukarüootset organismi, millel on keemiliselt sünteesitud genoom (9). Siiani kõige ambitsioonikam sünteetilise genoomi ehituse näide on iga liikmesinstituudi konstrueerimine ja tõrkeotsing ühest 16 pärmi kromosoomist. Järgmise paari aasta jooksul loodavad nad toota täielikult sünteetilise pärmi, millel on kõik need keemiliselt sünteesitud kromosoomid.

Eelmisel aastal avaldas The Scripps Research Institute'i Romesbergi rühm nn poolsünteetilise eluvormi loomise, mis andis esimesed tõendid sünteetiliste nukleotiididega mikroorganismi kohta genoomis (nimega X ja Y), mille kood oli edukalt transkribeeritud ja transleeritud, laiendades seeläbi elusrakkudele kättesaadavaid aminohappeid vahemikus 20-172 (10). Romesberg edastas oma tulemusi meediale ettevaatlikult, öeldes: "Ma ei nimetaks seda uueks eluvormiks, kuid see on kõige lähedasem asi, mida keegi on kunagi teinud" (11).

Tänapäeval on kõige lähedasem püüd ehitada midagi, mida võib tõeliselt nimetada sünteetiliseks eluks, konsortsium Build-a-Cell, mille eesmärk on moodustada sünteetilised rakud maapinnast moodulkomponentide abil. Teoreetiliselt võiks raku, millel on kõik põhiainevahetuseks, rakkude jagunemiseks, signaliseerimiseks ja mõneks muuks ülesandeks vajalikud geenid, pidada elusateks ja ehitada täielikult hästi iseloomustatud ehitusplokkidest.

Kuidas on lood organismidega, millel on täiesti uued funktsioonid - neid, mida looduses pole kusagil? Kuidas saavad sünteetilised bioloogid üle minna olemasolevate komponentide ümberjuhtimisele (mis on vaid osaliselt saavutatud) ja liikuda tundmatute valdkonda? Seda üleminekut piiravad mitmed väljakutsed, kuid see juhtub lõpuks. Kunstlikku eluvormi, mis põhineb olemasoleval organismil vaid lahtiselt, saab konstrueerida ainult siis, kui selle arendajal on täielik arusaam elu toimimisest ja ta suudab ennustada, kuidas iga komponent rakus käitub. Kuna valgud on üks olulisemaid viise, mille abil rakk oma funktsioone täidab, on mõistetav, et seda üleminekut võib hõlbustada valgufunktsioonide parem mõistmine ja võime kujundada valke, millel on täiesti uued funktsioonid.

Uute funktsioonidega sünteetiliste eluvormide väljatöötamisel on kolm peamist väljakutset. Ehkki siin esitatud näited pole mingil juhul ammendavad, hõlmavad need teaduslikke, tehnoloogilisi ja eetilisi.

Teaduslik väljakutse: valgu tundmatud funktsioonid

Sünteetiline bioloogia on teadusharu, mis sõltub genoomika, molekulaarbioloogia ja arvutamise paralleelsest arengust. Organismide kujundamiseks ettearvatavatel viisidel tuleb enne nende komponentide ümberkorraldamist ja ümberistutamist kindlalt mõista nende keerukusi, erinevusi ja, mis on olulisem, iga komponendi funktsiooni. See on teaduslik väljakutse.

Kaaluka näite leidmiseks olemasolevates silmatorkavates lünkades teaduslikes teadmistes, mida tuleb enne uue elu loomist käsitleda, tuleb vaadata kaugemale kui 2016. aastal lõpule viidud minimaalse genoomi ülesehitamise jõupingutused, milles Mycoplasma mükoidide genoom oli taandatud kõigest 473 geenini (12). Võib-olla on üllatav, et sellele jõupingutusele eelnes 2012. aastal Markus Coverti Stanfordi rühmas kogu raku mudeli loomine, mis põhineb lihtsal organismil Mycoplasma genitalium. (13) Hoolimata nende organismide lihtsusest (natiivsel suguelundil on ainult 525 geeni) ja nende mõistmiseks pühendatud intensiivsetele teaduslikele pingutustele, on M. mycoides'i 149 olulisel geenil tundmatu funktsioon (12).

Sünteetiliste eluvormide konstrueerimise põhipiirang on see, et ajalooliselt on peamine bioloogiliste uuringute läbiviimise meetod olnud geenide isoleerimine või väljalülitamine ja seejärel nende funktsiooni tuvastamine rakus. See lähenemisviis on kasulik, kuid võib olla puudulik kõigi sellega seotud keerukate funktsioonide uurimisel, kuna „... üks komponent (näiteks geen) kontrollib harva konkreetselt mingit konkreetset bioloogilist funktsiooni või haigust ja vastupidi, iga konkreetne komponent võib mõjutada palju erinevaid funktsioone ”(1). Et mõista, kuidas rakumiljöö komponendid oma funktsioone täidavad, on kanoonilised biokeemilised lähenemisviisid aeganõudvad ja töömahukad, kuid need võivad jääda vajalikuks. Funktsiooni ennustamiseks järjestusest on kasutatud ka muid süsteemitaseme lähenemisviise.

Kuude jooksul, mis järgnesid Venteri elujõulise, minimaalse raku avaldamisele, ennustasid Antoine Danchin ja Gang Fang evolutsioonianalüüsi abil mõnda tundmatut geenifunktsiooni, uurides kirjanduse kaudu, et teha kindlaks olulised geenid, mis täidavad põhifunktsioone seotud bakteriaalsetes klades, mida ei mainitud kui üks tuntud geenidest minimaalse genoomi mükoidides (14). Neid evolutsioonilisi suhteid kasutades pakkusid Danchin ja Fang välja identiteedid 149 tundmatust geenist 32 (14). Kuid minimaalne rakk (ja selle eelkäija) pole ainsad suhteliselt lihtsad organismid, mida on põhjalikult uuritud, ja evolutsioonilised suhted pole ainus viis valgu funktsioneerimise uurimiseks. Pärmiuurijad on juba ammu otsinud uusi meetodeid tundmatute geenide funktsiooni määramiseks. 2007. aastal oli pärmis üle 1000 iseloomustamata geeni (15).

Üks asi on homoloogiliste või evolutsiooniliste analüüside tegemine suurtes andmekogumites, kuid hoopis teine ​​asi on kõnealuse valgu eraldamine ja ensümaatiliste uuringute tegemine või geeni in vivo kustutamine selle mõju uurimiseks. Oluliste geenide korral on deletsioonist raskemini tulemusi saada, kuid valkude funktsioonide uurimiseks on veel võimalusi, näiteks fluorofooride jälgimine, immunosadestamine, immunoblotanalüüs ja farmakoloogilised inhibiitorid. Ehkki aeganõudev ja töömahukas, on ehk tõestatud vahenditel põhinev biokeemiline lähenemisviis funktsiooni määramiseks endiselt parim meetod.

Kui iga komponendi funktsioon on kindlaks tehtud, on järgmine samm süsteemitaseme lähenemisviiside kasutamine, et mõista, kuidas need toimivad suuremas raku kontekstis. See on süsteemibioloogide ülesanne, kes “püüavad mõista, kuidas bioloogilise süsteemi kõik üksikud komponendid toimivad ajas ja ruumis süsteemi toimimise määramiseks. See võimaldab saada teavet molekulaarbioloogia ja genoomiuuringute suures koguses, integreerituna füsioloogia mõistmisega, et modelleerida rakkude, elundite ja tervete organismide keerukat funktsiooni ”(16). Tänapäeval takistab sünteetilise elu rajamist valgu funktsiooni piiratud mõistmine.

Tehnoloogiline väljakutse: funktsiooni ennustamine järjestusest

Tulevikus oleks kasulik luua rakke, mis täidavad kohandatud eesmärki, isegi kui see eesmärk nõuab ensümaatilist funktsiooni või käitumist, mida looduses kuskil ei leidu. DNA valkude struktuuri ja funktsioonide ennustamisel tehtud edusammudega laieneb drastiliselt nende osade 'modulaarsus', mida saaks ühel päeval kasutada bioloogiliste organismide konstrueerimiseks alt üles. Kuigi mõned uurimisrühmad, sealhulgas Nobeli preemia laureaadi Frances Arnoldi rühm 2018. aastal töötavad täiesti uudsete funktsioonidega valkude loomise nimel, on hädasti vaja paremini mõista valkude funktsiooni ja vahendeid valkude struktuuri usaldusväärseks kujundamiseks. Täiesti „ebaloomulike” organismide tekkega seotud suur tehnoloogiline väljakutse on: milliseid meetodeid saab kasutada uudsete funktsionaalsustega valkude valmistamiseks ja kuidas meid piiratakse?

Valgu voltimise probleemiga on tegelenud paljud rühmad, võib-olla mitte ükski nii kuulus kui David Baker Washingtoni ülikoolis. Bakeri rühm on tähelepanuväärne (osaliselt) valkude struktuuri ennustamisprogrammi ROSETTA ja ROSETTA @ Home ning selle koduseks kasutamiseks mõeldud versiooni arendamiseks, milles inimesed saavad oma personaalarvutites töötada erinevate valkude madalaima energiastruktuuri lahendamiseks. (17). Baker on loonud ka spin-out ettevõtte nimega Arzeda, mis kasutab strukturaalseid ennustusplatvorme uute funktsionaalsustega ensüümide loomiseks, mida saab kasutada keskkonna, diagnostika ja terapeutiliste rakenduste jaoks (20).

Bakeri grupi ja teiste väljatöötatud arvutusprogramme on kasutatud täiesti ainulaadse valguvoldi kujundamiseks, mida looduses ei leidu (18), ja valkude-valkude liideste kavandamiseks terapeutilises disainis (19). Kuid üks täiesti piiratud bioloogiliste struktuuride kujundamise praegune piirang on arvutusvõimsus. Ab initio simulatsioonid tavaliselt proovivad ja testivad paljusid konformatsioonilisi valguolekuid, et tuvastada madalaima vaba energiaga struktuurid (20, 21). Aastal 2009 võiks tipptasemel superarvuti simuleerida 50-jääkset valku, aatomite kaupa, ühe millisekundi jooksul. Sellest ajast alates on personaalarvutid selle võime ületanud (22, 23).

Kahjuks on valgu funktsiooni ennustamine DNA järjestusest palju keerukam kui valgu struktuuri ennustamine. Valgu funktsioonide ennustamise võime võimaldaks täiesti uute tegevustega valkude kiire ja ratsionaalse kavandamise. Frances Arnoldi grupp California Tehnoloogiainstituudis tegeleb selle probleemiga, kasutades olemasolevate ensüümide optimeerimiseks ja uute leiutamiseks kõige võimsamat bioloogilise kavandamise protsessi evolutsiooni abil, hoides sellega mööda meie sügavast teadmatusest, kuidas järjestus kodeerib. "Evolutsioon on nii suur tööriist uute valkude arendamiseks osaliselt seetõttu, et kasuliku uue funktsiooni rakendamiseks vajalikud mutatsioonid on sageli väga intuitiivsed. Ehkki enamik substraadi spetsiifilisuse või selektiivsuse eest vastutavaid aminohappeid leidub aktiivsaidis, võivad aktiivsest kohast eemal asuvate aminohapete muutused põhjustada ka drastiliselt tõhustatud katalüütilist aktiivsust (24).

Arvestuse, kujundamise ja evolutsiooniga hõlmatud lähenemisviiside kulminatsioon õnnestub kõige tõenäolisemalt disaini teel üha keerukamate valkude loomisel.

Ühiskondlik ja eetiline väljakutse

Sünteetilise bioloogia eetika on alates 2000. aasta alguses avaldatud geeniringluse esimestest aruannetest tuliselt vaidlustatud ning 2010. aastal keemiliselt sünteesitud genoomi käsitlevas aruandes kutsuti Obama administratsiooni üles looma bioeetikakomisjon, et käsitleda sünteetilise bioloogia uusi võimalusi ( 25). Selle algatuse käigus väitsid eetikud, et kui teadlastel õnnestub organism luua, võib elu ise kaotada oma eristaatuse (26). Teisisõnu, inimesed hakkaksid elu käsitlema kui midagi keerulist biokeemilist reaktsiooni, mida saab laboris korrata, ja reduktsionistliku sünteetilise organismi loomine kahjustaks seda eristaatust.

Sünteetilise elu loomise vastu suunatud reduktsionistlik moraalne argument on seotud ka metodoloogilise reduktsionismiga - strateegiaga, mida inseneridistsipliinid on ära kasutanud, et süstemaatiliselt vähendada komponente, et veelgi paremini mõista, kuidas tervik on üles ehitatud. See kehtib sünteetilise bioloogia standardimise kohta, kus igat komponenti iseloomustatakse eraldi, kuid süstemaatilise bioloogilise standardimise osas pole eetiliselt olnud mingit tagasilööki. Need on aga samad reduktsionistlikud põhimõtted, mis võimaldavad sünteetilise eluvormi loomist. Lõpuks ei ole ühtegi tõendit, mis viitaks sellele, et varasemad selles artiklis mainitud poolsünteetilise elu ja sünteetiliste genoomidega organismide loomise katsed on mingil moel kahjustanud eristaatust, mille inimesed omistavad elusorganismidele hoolimata meedia tähelepanust.

Sellegipoolest on enne sünteetiliste eluvormide loomist kaaluda peamisi eetilisi punkte. Weitze ja Pühleri ​​esitatud juhised on eriti mõistlikud (27). Esiteks, kas teadlastel on kõik asjakohased teadmised ja põhjalikud teadmised kõnealusest tehnoloogiast? See, et teadlased saavad midagi üles ehitada, ei tähenda veel, et peaksid. Sellest lähtuvalt peaksid teadlased püüdma täielikult mõista (võimaluse korral!) Organismi bioloogilisi põhimõtteid, et võimalikke probleeme saaks ennetada või leevendada.

Arvesse tuleb võtta ka uudse sünteetilise organismi võimalikke kahjusid. Inimesed kasutavad tehnoloogiat sageli ootamatutel viisidel, seetõttu on oluline, et sünteetilise organismi võimalike rakenduste üle arutataks ennetavalt. Valitsuse määruste ja eetiliste kaalutlustega tuleks arvestada juba ammu enne tegeliku ehituse alustamist.

Suurbritannia insenertehniliste ja füüsiliste teaduste rahastamise peamise rahastamisagentuuri EPSRC (Engineering and Physical Sciences Research Council) välja töötatud vastutustundliku teadusuuringute ja uuendustegevuse raamistik nõuab sünteetilise bioloogia teadusuuringute läbiviimist AREA abil, mis tähistab "Enneta, peegelda" , Engage and Act (28). Teadlased peaksid enne selle alustamist uurima täielikult oma uurimisprojekti mõju, mõtlema läbi uurimistöö eesmärgid, suhtlema väljaspool oma distsipliini asuvate inimestega, sealhulgas bioeetikutega, ning seejärel tegutsema nende protsesside kallal ja kujundama oma uurimistöö suuna projekti vastavalt.

Järgnevatel aastakümnetel kavandatakse ja ehitatakse täiesti ainulaadsete, ebaloomulike funktsioonidega rakke. Täna tehtud edusammud on sammuks selle suurema eesmärgi saavutamisel ja see võib käivitada uue sünteetilise bioloogia ajajärgu, kus organismid tehakse ad hoc, et tegeleda mõne maailma pakilisema probleemiga.

Viited

1. “Sünteetiline bioloogia: ulatus, rakendused ja mõjud.” Kuninglik tehnikaakadeemia. Mai 2009. Ligipääs 2. detsembril 2017.

2. Jacob F ja Monod J. “Geneetilised regulatsioonimehhanismid valkude sünteesis.” Journal of Molecular Biology 3, 318–356 (1961).

3. Gardner TS, Cantor CR ja Collins JJ. “Geneetilise lüliti ehitamine Escherichia coli-s.” Nature 403, 339–342 (2000).

4. Elowitz MB ja Leibler S. “Transkriptsiooniliste regulaatorite sünteetiline võnkevõrk.” Nature 403, 335–8 (2000).

5. Chan LY, Kosuri S ja Endy D. “Refaktoriseeriv bakteriofaag T7.” Mol Syst Biol 1 (2005).

6. Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, et al. “Geenivaramu siirdamine bakterites: ühe liigi vahetamine teise vastu.” Science 317, 632–8 (2007).

7. Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C jt. “Mycoplasma genitalium genoomi täielik keemiline süntees, montaaž ja kloonimine.” Science 319, 1215–20 (2008).

8. Gibson DG, Glass JI, Lartigue C jt. “Keemiliselt sünteesitud genoomi kontrolli all oleva bakteriraku loomine.” Science 329, 52–6 (2010).

9. Annaluru N, Muller H, Mitchel LA jt. “Funktsionaalse kujundaja eukarüootse kromosoomi täielik süntees.” Teadus 344, 55–8 (2014).

10. Zhang Y, Ptacin JL, Fischer EC, et al. “Poolsünteetiline organism, mis salvestab ja hangib suurenenud geneetilist teavet.” Nature 551, 644–47 (2017).

11. „Teadlased loovad esimese poolsünteetilise organismi, mis salvestab ja hangib ebaloomulikku teavet.“ Scripps Research Institute'i pressiteade. 29. november 2017. Juurdepääs 2. detsembril 2017.

12. Hutchison CA, Chuang R, Noskov VN jt. “Minimaalse bakteri genoomi kujundamine ja süntees.” Teadus 351, 1414 (2016).

13. Karr JR, Sanghvi JC, Macklin DN jt. “Terverakuline arvutuslik mudel ennustab genotüübist fenotüüpi.” Cell 150, 389–401 (2012).

14. Danchin A ja Fang G. “Tundmatud tundmatud: olulised geenid funktsiooni otsimisel.” Microb Biotechnol 9, 530–40 (2016).

15. Peña-Castillo L ja Hughes TR. “Miks on endiselt üle 1000 iseloomustamata pärmigeeni?” Genetics 176, 7–14 (2007).

16. “Süsteemibioloogia: visioon insenerist ja meditsiinist.” Arstiteaduste akadeemia ja Kuninglik inseneriakadeemia (2007).

17. Kaufmann KW, Lemmon GH, DeLuca SL, Sheehan JH ja Meiler J. “Praktiliselt kasulik: mida saab teie heaks teha ROSETTA valgu modelleerimise komplekt.” Biochemistry 49, 2987–98 (2010).

18. Kuhlman B, Dantas G, Ireton GC, Varani G, Stoddard BL ja Baker D. “Uue aatomitaseme täpsusega globaalse valguvoldi kujundamine.” Science 302, 1364–68 (2003).

19. Ashworth J, Havranek JJ, Duarte CM jt. Endonukleaasi DNA sidumise ja lõhustamisspetsiifilisuse arvutuslik ümberkujundamine. Loodus 441, 656–59 (2006).

20. Jiang L, Althoff EA, Clemente FR jt. “Retroaldoolensüümide arvutuslik disain de novo.” Science 319, 1387–91 (2008).

21. Simons KT, Bonneau R, Ruczinski I ja Baker D. “CAS Initiative'i valkude abstraktne valgu struktuuri ennustamine Rosetta abil.” Proteins 37, 171–76 (1999).

22. Shaw DE, Bowers KJ, Edmond C jt. “Kõrgjõudlusega arvutivõrkude loomise, säilitamise ja analüüsi konverentsi toimingud - SC '09.” (2009).

23. Pierce LCT, Salomon-Ferrer R, de Oliveira CAF jt. „Kiire molekulaarse dünaamikaga tavapärane juurdepääs millisekundi aja skaala sündmustele.” J Chem Theory Comput 8, 2997–3002 (2012).

24. Tracewell CA ja Arnold FH. “Ensüümi suunatud areng: ronimisvõimekuse tipptasemel on üks aminohape korraga.” Curr Opin Chem Biol 13, 3–9 (2009).

25. Pollack A. “USA Bioeetikakomisjon annab sünteetilisele bioloogiale rohelise tule. ”The New York Times. 16. detsember 2010.

26. Cho MK, Magnus D, Caplan AL ja McGee D. “Eetilised kaalutlused minimaalse genoomi sünteesimisel.” Science 286, 2087–89 (1999).

27. Weitze M ja Pühler A. “Sünteetiline bioloogia - inseneriteaduse poole.” European Review 22, S102–12 (2014).

28. „Vastutustundliku innovatsiooni raamistik“. Inseneriteaduste ja füüsikaliste teaduste teadusnõukogu.